style="width:10.3733in;height:4.93988in" /> 本文是学习GB-T 19163-2010 牛蛙. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准确立了牛蛙(Rana catesbeiana
Shaw)的名称与分类、主要形态构造特征、生长与繁殖、遗传
学特性、检测方法及结果判断。
本标准适用于牛蛙的种质检测与鉴定。
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 18654.1 养殖鱼类种质检验 第1部分：检验规则
GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法
GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型分析
GB/T 25884 蛙类形态性状测定
GB/T 25884 确立的术语和定义适用于本标准。
牛蛙(Rana catesbeiana Shaw)。
无尾目(Anura)、 蛙科(Ranidae)、蛙属(Rana)。
身体粗短，头部宽而扁，略呈三角形，1对圆形鼓膜位于眼后方，鼓膜颜色与头部背面颜色基本一
致，沿眼后到鼓膜上方有明显的皮肤褶。皮肤较光滑，背部略显粗糙，有极微细的肤棱。前肢4指，无
蹼，指序为Ⅱ、I、IV、Ⅲ,雄蛙第一指内侧有发达的婚垫，生殖季节显著增大，雌蛙没有婚垫；后肢特别发
达，5趾，全蹼，蹼不完全达趾端，趾序为 I、Ⅱ、V、Ⅲ、IV。
体色随栖息环境、年龄、性别、营养状况而异。通常头部为绿色，背部为绿褐色、黄褐色或黑褐色，有 深浅不一的不规则状斑块或斑纹，腹部为灰白色，有暗灰色斑纹。成熟雄蛙下颌部为金黄色，雌蛙则与
腹部颜色一致。
牛蛙外部形态见图1。
GB/T 19163—2010
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背面观
对于体长10.3 cm～16.1cm,
腹面观
图 1 牛蛙外形(含 )
体重175.2 g～548.7g 的牛蛙，实测性状比例值见表1。
表 1 实测可量性状比例值
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雄蛙咽部有1对内声囊，开口于口咽腔；雌蛙无声囊。
颈椎骨1枚、躯椎骨7枚、荐椎骨1枚、尾杆骨1枚。属前凹后凸的参差型椎体。
成熟雄体有一对浅黄色卵圆形的精巢，保留有退化状态的缪勒氏管。成熟雌体有一对囊状结构的
卵巢，卵巢内含有淡黄色的早期卵和动物极为黑色、植物极为乳白色的成熟卵或接近成熟卵。
生殖腺的前方各有一个指状脂肪体，性成熟前为白色或淡黄色，性成熟后为黄色，大小随季节及营
养状况等因素变化。
养殖条件下牛蛙体长、体重的实测值见表2。
表 2 养殖条件下牛蛙的体长、体重实测值
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style="width:3.95331in;height:4.36018in" />GB/T 19163—2010
性成熟年龄为2龄。
北方地区为5月份～8月份，湖南、湖北等省为4月份～9月份，广东、福建等省为3月份～11月
份，适宜产卵水温20℃~30℃。
性成熟雌蛙每年可产卵1次～2次，并以春季产卵为主。卵球形，卵径1.2
mm～1.5 mm,动物极
深黑色，植物极乳白色，产出的卵外包胶质膜，相互粘连成单层或团状卵块。
性成熟雌蛙生殖季节卵巢系数为12.6%～27.6%,绝对怀卵量(5.0±0.77)×10⁴粒，相对怀卵量
(106.7±8.69)粒/g。
牛蛙体细胞染色体数：2n=26, 臂数(NF):52, 核型公式：2n=22 m+4 sm。
牛蛙染色体组型见图2。
《 ×86X××X
X 入X X X X X X
图 2 牛蛙染色体组型图
牛蛙心肌的乳酸脱氢酶(LDH) 同工酶电泳酶谱见图3,酶带扫描图见图4。
XX
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十
图 3 牛蛙心肌 LDH 同工酶电泳酶谱
按 GB/T 18654.2 的规定执行。
图 4 牛蛙心肌 LDH 同工酶酶带扫描图
GB/T 19163—2010
剪取牛蛙第2趾骨，清洗晾干。
将材料放入80%乙醇中硬化10 h～15h, 在3%硝酸溶液中脱钙24 h
左右，使其软化，然后按常规
石蜡切片方法制片。
在显微镜(10×20)下可观察到黑色狭窄带与淡红色宽带间隔的排列，黑色带即为年轮标志，1个年
轮记为1龄，2个年轮记为2龄，依此类推。
按GB/T 25884 的规定执行。
在繁殖季节，解剖未产卵的雌亲蛙，取出卵巢，用电子秤称重，再称取1.0 g
卵，2个样品，分别计数
每克卵的平均卵粒数。卵巢中所含的全部卵粒数即为绝对怀卵量，单位体重(g)
所含的卵粒数为相对
怀卵量。
术前8 h～12h 腹腔注射质量分数为0.1%的植物血凝聚素(PHA)0.5 mL～1.0
mL(每100 g 体 重),术前4 h~6h
腹腔注射秋水仙素溶液(每克体重10μg～15μg);解剖牛蛙，从股骨和胫骨中取骨
髓放入质量分数为0.4%的氯化钾(KCI) 溶液中，37℃水浴15 min～20 min。 以1000
r/min 离心 10 min,弃其上清液，加1 mL
固定液(甲醇：冰乙酸为3:1),4℃条件下固定20 min, 重复固定2次。
再加少量固定液，制取细胞悬液；取细胞悬液滴片，在酒精灯上文火烘干，浸没在吉姆萨(Giemsa)
工作
液(配制按 GB/T18654.12 的规定执行)中染色30
min,用蒸馏水冲去多余染液，空气干燥制片。
按GB/T 18654.12 的规定执行。
解剖牛蛙，取心肌，用生理盐水洗去血液后称重、切碎，按质量体积比1:5加生理盐水低温匀浆，
4℃条件下以12000 r/min 离心10 min。
取上清液加入等量40%的蔗糖溶液，摇匀后作好标记置于
-25℃冰箱中保存。
用水平平板电泳仪及质量分数为6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用溴酚蓝作指示剂。加样前，
50 mA预电泳30 min;加样后，稳压280V, 电泳80 min～90
min,至溴酚蓝到达距胶前沿1cm 处停止。
电泳结束后，取凝胶放入预先配好的染色液中，37℃温浴10 min～30
min,至条带清晰，倾出染色
液，用固定液(按甲醇：乙酸：水的体积比为45:12:43配制)终止反应。
同工酶染色液配制见附录 A。
用激光扫描仪对电泳图谱进行扫描分析。
按GB/T 18654.1 的规定执行。
GB/T 19163—2010
(规范性附录)
同工酶染色液的配制
A.1 磷酸盐缓冲液(0.5 mol/L) 的配制
取磷酸二氢钾(KH₂PO)6.8g 溶于约80 mL 蒸馏水中，以氢氧化钠(NaOH) 溶液(2
mol/L) 调节
pH 至7.4,再用蒸馏水定容至100 mL。
A.2 氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 贮液(mg/mL) 的配制
取50 mg 氯化硝基四氮唑蓝(NBT) 定容于50 mL 蒸馏水中，4℃保存。
A.3 辅酶 I(NAD) 贮液(mg/mL) 的配制
取100 mg 辅 酶 I(NAD) 定容于10 mL 蒸馏水中。
A.4 吩嗪甲酯硫酸盐(PMS) 贮液(mg/mL) 的配制
取50 mg 吩嗪甲酯硫酸盐(PMS) 定容于50 mL 蒸馏水中，4℃暗处保存。
A.5 氯化钠(NaCI) 溶液(0.1 mol/L) 的配制
取氯化钠584 mg 定容于100 mL 蒸馏水中。
A.6 氯化镁(MgCl₂) 溶液(0.005 mol/L) 的配制
取氯化镁(MgCl₂ ·6H₂O)100 mg 定容于100 mL 蒸馏水中。
A.7 乳酸钠溶液(1 mol/L) 的配制
取 DL- 乳酸钠9.35 mL (浓度600 mg/mL) 加蒸馏水至50 mL。
A.8 染色液的配制
取磷酸盐缓冲液(A.1)7.5 mL,加氯化硝基四氮唑蓝溶液(A.2)7.5 mL、辅 酶 I
溶 液(A.3)
3.0 mL、吩嗪甲酯硫酸盐溶液(A.4)0.75 mL、氯化钠溶液(A.5)3.0
mL、氯化镁溶液(A.6)3.0 mL、
乳酸钠溶液(A.7)3.0 mL,混匀即成。
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